Proteínas

     Al igual que los péptidos, las proteínas se forman a partir de amino ácidos a través de enlaces amida. Covalentemente constituyentes heteroátomos enlazados también se pueden incorporar en las proteínas. Por ejemplo, fosfoproteínas como la caseína de la leche o fosvitina de la yema de huevo contienen ésteres de ácido fosfórico de residuos de serina y treonina. La estructura de una proteína depende de la secuencia de aminoácidos (la estructura primaria) que determina la conformación molecular (estructuras secundaria y terciaria).

     Las proteínas a veces se producen en forma de agregados moleculares que están dispuestas de una manera geométrica ordenada (estructura cuaternaria). Las secuencias y conformaciones de un gran número de proteínas se han elucidado y grabado en varias bases de datos.

Grupos terminales

     Aminoácidos N-terminales se pueden determinar mediante el tratamiento de una proteína con l-fluoro-2,4- dinitrobenceno o cloruro de 5-dimetilaminonaftaleno-1-sulfonilo (cloruro de dansilo). Otra posibilidad es la reacción con cianato, seguido de la eliminación del aminoácido N-terminal en forma de hidantoína, y la separación y recuperación del ácido amino por escisión de la hidantoína. El aminoácido N-terminal (y la secuencia de aminoácidos cerca de la N-terminal) es accesible por hidrólisis con aminopeptidasa, en cuyo caso se debe recordar que la velocidad de hidrólisis depende de cadenas laterales de aminoácidos y que los residuos de prolina no son troceados. Se requiere un procedimiento especial cuando el residuo N-terminal se acila (aminoácidos N-formil- o N-acetilo, o ácido piroglutámico). Determinación de los aminoácidos C-terminales es posible mediante el procedimiento recomendado por hidrazinolisis Akabori:

     El aminoácido C-terminal se separa de las hidrazidas de aminoácidos, e. g., por una resina de intercambio catiónico, e identificado. Es posible marcar el aminoácido C-terminal a través de la valoración selectiva a través de oxazolidinona:

     Los aminoácidos C-terminales se pueden eliminar enzimáticamente por la carboxipeptidasa A, que preferentemente escinde aminoácidos con cadenas laterales alifáticas aromáticas y grandes, carboxipeptidasa B que preferentemente se escinde la lisina, ácidos de arginina y aminoácidos con cadenas laterales neutras o carboxipeptidasa C que escinde con menos especificidad pero escinde prolina.

La hidrólisis parcial

     Más largas cadenas de péptidos son generalmente fragmentadas. Los fragmentos se separan luego y se analizan individualmente para secuencias de aminoácidos. Escisión enzimática selectiva de enlaces peptídicos se logra principalmente con tripsina, que escinde exclusivamente Lys-Arg-X y X-bonos, y la quimotripsina, que escinde enlaces peptídicos con menor especificidad (Tyr-X, X-Phe, Trp-X y Leu -INCÓGNITA). El ataque enzimático puede ser influenciado por la modificación de la proteína. Por ejemplo, acilación del grupo ε-amino de lisina de los límites de hidrólisis tríptica a Arg-X, mientras que la sustitución de la SHgroup de un residuo de cisteína con un grupo aminoetilo introduce una nueva posición de escisión para la tripsina en la molécula "residuo pseudolysine"):

     También adecuado para la hidrólisis enzimática específica de las cadenas de péptidos es la endoproteinasa Glu-C de Staphylococcus aureus V8. Escinde enlaces Glu- X (tampón de carbonato de amonio de pH 7,8 o acetato de amonio tampón de pH 4,0), así como Glu- x más enlaces Asp-X (tampón de fosfato de pH 7,8). El método químico más importante para la escisión selectiva utiliza bromuro de cianógeno (BrCl) para atacar los vínculos Met-X (reacción 1.86). La hidrólisis de proteínas con ácidos fuertes revela una diferencia en las velocidades de hidrólisis de enlaces peptídicos en función de la cadena lateral del aminoácido adyacente. Bonds que implican grupos amino de serina y treonina son particularmente susceptibles a la hidrólisis. Este efecto es debido a

Migración N → O-acilo a través de la oxazolina y posterior hidrólisis del enlace éster:

     La hidrólisis de proteínas con ácidos diluidos preferencialmente escinde aspartil-X-bonos.

La separación de los fragmentos de péptido se consigue por cromatografía en columna de gel y de intercambio iónico utilizando un tampón volátil como eluyente (piridina, acetato de morfolina) que se puede eliminar por liofilización de las fracciones recogidas. La separación de péptidos y proteínas por HPLC de fase inversa ha ganado gran importancia, utilizando tampones volátiles mezclados con disolventes orgánicos, solubles en agua como la fase móvil.

     La fragmentación de la proteína se lleva a cabo por diferentes enzimas y / o técnicas químicas, por lo menos por dos enzimas de diferente especificidad. La disposición de los péptidos obtenidos en el mismo orden como se presentan en la proteína intacta se lleva a cabo con la ayuda de secuencias que se solapan. El principio de este método se ilustra para la subtilisina BPN.